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產(chǎn)品名稱：RT-PCR Kit (With gDNase) 第一鏈合成試劑盒(去基因組)
產(chǎn)品編號(hào)：BLGE169
產(chǎn)品規(guī)格：
| 產(chǎn)品組成 |
BLGE169-01 (25rxn) |
BLGE169-02 (100rxn) |
BLGE169-03 (500rxn) |
| 5×gDNA Buffer | 50μl | 200μl | 5×BLGE169-02 |
| RT Primer Mix | 50μl | 200μl | |
| RT Enzyme Mix | 25μl | 100μl | |
| 10× RT Buffer | 50μl | 200μl | |
| RNase Free ddH2O | 1ml | 2×1ml |
 |
說明書 |
產(chǎn)品情況：RT-PCR Kit(With gDNase)第一鏈合成試劑盒包含了最新開發(fā)的逆轉(zhuǎn)錄酶和緩沖系統(tǒng)，可在提高cDNA合成效率的同時(shí)，快速去除基因組中DNA污染，以保證后續(xù)定量結(jié)果的穩(wěn)定、可靠。本品廣泛適用于動(dòng)物、植物及微生物RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物可兼容染料法和探針法qPCR、cDNA文庫構(gòu)建、SAGE（基因表達(dá)連續(xù)分析）、引物延伸等多種實(shí)驗(yàn)方案，產(chǎn)品特色如下：
1.逆轉(zhuǎn)錄效率高達(dá)95%以上；
2.gDNase組分可在42℃ 3min內(nèi)去除gDNA，可避免Total RNA中基因組DNA的干擾；
3.RT Enzyme增加了疏水motif，具有更強(qiáng)的RNA親和力和熱穩(wěn)定性，可在42℃ 15min完成cDNA第一鏈的合成；
4.通讀常規(guī)與復(fù)雜模板，快速解讀GC含量高、二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的RNA模板；
5.對(duì)不同物種來源及雜質(zhì)較多的RNA模板適用性高，可配合熒光定量檢測產(chǎn)品提高靈敏度和穩(wěn)定性。
儲(chǔ)存運(yùn)輸：本品需使用干冰運(yùn)輸，-40~-20℃可保存一年。
注意事項(xiàng)：
（一）高質(zhì)量的RNA對(duì)于制備cDNA至關(guān)重要，實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)用電泳驗(yàn)證RNA的完整性；實(shí)驗(yàn)全程請(qǐng)?jiān)诒喜僮?，以防RNA降解。
（二）對(duì)于二級(jí)結(jié)構(gòu)很復(fù)雜的RNA模板，推薦使用變性步驟（模板RNA 65℃孵育5min，繼而轉(zhuǎn)移至冰上待下一步操作）。
（三）PCR反應(yīng)有非特異性擴(kuò)增時(shí)，可將逆轉(zhuǎn)錄溫度升到50℃。
（四）根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求可選用Oligo-dT Primer或Gene Specific Primer，引物使用量可選用Oligo-dT Primer 50pmol/20μl反應(yīng)體系，Gene Specific Primer 5pmol/20μl反應(yīng)體系。
（五）下列操作步驟適用于模板量為總RNA≤2μg，如大于2μg請(qǐng)按比例擴(kuò)大反應(yīng)體系。
實(shí)驗(yàn)流程：
（一）自備產(chǎn)品
RNase-free 1.5ml離心管、0.2ml PCR管、移液器及吸頭、PCR儀、冰或移動(dòng)冰盒
（二）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1.設(shè)定模板50ng-2μg總RNA的20μl反應(yīng)體系；
2.冰上解凍模板RNA；
3. 5×gDNA Buffer、RT Primer Mix、10×RT Buffer、RNase-Free ddH2O室溫解凍后，迅速置于冰上；
4.使用前將每種溶液振蕩混勻，并可快速離心收集液體；
注意：請(qǐng)于冰上完成以下實(shí)驗(yàn)步驟，并為保證反應(yīng)液配制的準(zhǔn)確性，建議先配制成Mix，然后再分裝到每個(gè)反應(yīng)管中。
（三）去除基因組DNA
1.在RNase-free 1.5ml離心管中配制以下溶液A：
| 5×gDNA Buffer | 2μl |
| 模板RNA | Total RNA: 1pg ~1µg |
| RNase-Free ddH2O | 補(bǔ)足到10μl |
（四）逆轉(zhuǎn)錄體系配制
1.在RNase-free 1.5ml離心管中配制以下溶液B：
| 10 × RT Buffer | 2μl |
| RT Enzyme Mix | 1μl |
| RT Primer Mix | 2μl |
| RNase-Free ddH2O | 補(bǔ)足到10μl |
3.將溶液B加到溶液A中，充分混勻。
（五）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
| 42℃ | 15min |
| 95℃ | 3min |
常見問題及處理方案：
| 低得率 |
A．RNA模板中含有RNase酶，致使RNA降解、cDNA產(chǎn)物量少或無； B．RNA模板中含有蛋白、鹽離子、EDTA、乙醇、酚等雜質(zhì)，影響逆轉(zhuǎn)錄酶活性； C．以上操作步驟適用于模板RNA量為50ng-2μg；當(dāng)模板量≥2μg，請(qǐng)按比例擴(kuò)大此反應(yīng)體系。 |
| 后續(xù)實(shí)驗(yàn) | A．若后續(xù)為實(shí)時(shí)熒光定量PCR，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加入量應(yīng)小于PCR體系終體積的1/10；如100μl的PCR反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加入量應(yīng)不超過10μl。 |
| 保存 |
A．逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可置于冰上短暫保存，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)； B．如需要長期保存，請(qǐng)置于-20℃。 |
本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于臨床診斷！