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產(chǎn)品名稱：TRNzol Total RNA Extraction Reagent TRNzol 總 RNA 提取試劑

產(chǎn)品編號：BLGE114

產(chǎn)品規(guī)格：100 mL

說明書

產(chǎn)品情況：TRNzol Total RNA Extraction Reagent是基于傳統(tǒng)TRNzol開發(fā)的總RNA提取試劑。本品適用范圍廣泛，靈敏度、裂解能力和穩(wěn)定性更高，可快速、充分的從細菌、病毒、微生物、動物、植物的組織、細胞和體液等樣本中提取總RNA，并保證其完整性。
本品可最大限度消除DNA和蛋白等雜質(zhì)的污染，在分子克隆、Northern Blot、PolyA篩選、體外翻譯、RNase保護分析等多種實驗方案中實驗穩(wěn)定，結(jié)果可靠。對于小量樣品（50-100mg組織、5×10⁶細胞），或大量樣品（≥1g組織或≥10⁷細胞）的總RNA提取需求均可滿足。

儲存運輸：本品2~8℃避光保存或運輸，保質(zhì)期12個月。

注意事項：
（一）使用本品時注意防護，如果不慎接觸到眼睛，請立即用大量清水沖洗并前往醫(yī)院治療；接觸到皮膚，請立即用大量去垢劑和清水沖洗，如仍有不適，請前往醫(yī)院治療。
（二）RNA提取的關(guān)鍵在于防止RNase污染，請：
1.更換一次性手套；
2.在潔凈區(qū)域操作；
3.佩戴口罩，避免在操作過程中講話；
4.使用RNase-Free的塑料制品和槍頭；
5.使用150℃烘烤4小時的方式清潔玻璃類器皿；
6. 0.5M NaOH中浸泡10min的方式清潔塑料類器皿；
7.使用RNase-Free ddH₂O配制溶液；
8. RNase-Free ddH₂O分裝保存，RNA實驗用試劑專用。
（三）樣本保存
1. -70℃可保存勻漿后的樣品1個月；
2. RNA沉淀可保存于75%乙醇，2-8℃ 1周或-20℃ 1年。

實驗流程：
（一）自備產(chǎn)品
氯仿、異丙醇、75%乙醇(RNase-Free ddH₂O配置)、RNase-Free ddH₂O
（二）樣品處理
1.細胞
1.1貼壁細胞
收集的細胞數(shù)量請不要超過1×10⁷；可直接在體積不超過10cm²培養(yǎng)容器中裂解，或使用胰蛋白酶處理后，離心收集細胞沉淀。
1）直接裂解法
Ø 去除培養(yǎng)液后，用1×PBS清洗細胞；
Ø 在培養(yǎng)容器中加入TRNzol Total RNA Extraction Reagent試劑裂解細胞，每10cm²面積加入1 ml本品；
Ø 將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中用移液器反復吹打，至充分裂解，室溫靜置5 min。
注意：本品吸取量取決于培養(yǎng)板面積，而非細胞數(shù)。請充分將本品覆蓋至細胞表面，并用移液器吹打使之脫落；對于貼壁牢固的細胞可用細胞刮剝離。
請適量加足TRNzol Total RNA Extraction Reagent的用量，如本品使用量不足可導致提取的RNA中摻入DNA污染。
2）胰蛋白酶處理法
Ø 去除培養(yǎng)液后，用1×PBS清洗細胞；
Ø 去除PBS后，加入含0.25%胰蛋白酶的PBS處理細胞。待細胞脫離容器壁時，加入含有血清的培養(yǎng)基終止反應；
Ø 將細胞溶液轉(zhuǎn)移至RNase-Free的離心管中，300×g離心5min，收集細胞沉淀；
Ø 每5×10⁶~1×10⁷細胞中加入1ml TRNzol Total RNA Extraction Reagent試劑裂解細胞，室溫靜置5min。
注意：收集細胞時請將細胞培養(yǎng)液除凈，否則可因裂解不完全導致RNA的產(chǎn)量降低。
1.2懸浮細胞
Ø 離心取細胞；
Ø 每5×10⁶~1×10⁷動物或植物細胞中加入1ml TRNzol Total RNA Extraction Reagent試劑；
Ø 移液器反復吹打至充分裂解，室溫靜置5min。
注意：加入本品前不要洗滌細胞，以免降解mRNA。
2.組織
2.1動物組織
Ø 液氮速凍新鮮組織，并快速轉(zhuǎn)移至液氮預冷的研缽中，研磨至無明顯顆粒的粉末狀；
Ø 每30~50mg組織加入1ml TRNzol Total RNA Extraction Reagent試劑，樣品體積一般不要超過本品體積的10%；
Ø 靜置樣品混懸液5min，待完全融化后吹打至裂解液透明。
2.2植物組織
Ø 液氮研磨新鮮葉片或?qū)⑷~片剪碎后在含TRNzol Total RNA Extraction Reagent試劑的研缽中研磨，控制時間在1min內(nèi)；100mg葉片請使用1ml本品；
Ø 靜置樣品混懸液5 min，待完全融化后吹打至裂解液透明。
3.病毒液與血液
Ø 取新鮮的血液或病毒液加入3倍體積TRNzol Total RNA Extraction Reagent試劑充分振蕩混勻；
Ø 室溫放置5min，使核酸蛋白復合物完全分離。
（三）RNA分離
1. 4℃ 12,000rpm(~13,400×g)離心10min，取上清。
注意：含較多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物結(jié)節(jié)的樣品可使用離心方式去除，收集的沉淀包括細胞外膜、多糖、高分子量DNA，在上清中含有RNA。在制備脂肪組織樣品時，應除去上層的大量油脂，取澄清的勻漿溶液進行后續(xù)操作。
2.每使用1ml TRNzol Total RNA Extraction Reagent試劑加入0.2ml氯仿，混合均勻后用渦旋儀劇烈振蕩15sec，或手動快速顛倒混勻2min。
3.室溫放置3min后，于4℃ 12,000rpm(~13,400×g)離心15min，此時樣品將分為三層：粉色的，為有機相；中間層和上層無色的，為水相，RNA主要在水相。將水相（約500µl）轉(zhuǎn)移至新的離心管中。
4.將得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，混勻。
5.室溫放置10 min后，于4℃ 12,000rpm(~13,400×g)離心10min，去上清。
注意：離心前RNA沉淀常不易發(fā)現(xiàn)，離心后可在管側(cè)和管底觀察到膠狀沉淀。
6.用RNase-Free ddH₂O配置75%乙醇，取1ml洗滌沉淀。
注意：按TRNzol Total RNA Extraction Reagent：75%乙醇為1:1的比例使用，如每使用1ml TRNzol Total RNA Extraction Reagent試劑，請取用1ml 75%乙醇洗滌沉淀。
7. 4℃ 10,000rpm(~9,391×g)離心5min后，廢棄液體。注意不要倒出沉淀，剩余的少量液體短暫離心后，用槍頭吸出。
注意：保留沉淀，不要誤棄。
8.室溫放置晾干后，根據(jù)實驗需求加入30-100µl RNase-Free ddH₂O，反復吹打，充分溶解RNA。
注意：RNA不要晾的過干，以防后期RNA難以溶解?？馗蓵r間請控制在2-3min。
9.待RNA完全溶解后，取少量檢測，其余在-80℃保存。
注意：RNA可以分裝于-85~-65℃長期保存，而-30~-15℃僅可短期保存。
10.產(chǎn)物檢測方案
Ø 濃度：采用分光光度計檢測，RNA濃度(ng/µl)=OD₂₆₀×稀釋倍數(shù)×40；或采用Qubit直接檢測。
Ø 純度：采用分光光度計檢測，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8~2.2之間表明RNA純度較高。
Ø 完整性：取0.5~1µgRNA，用1×TE或RNase-Free ddH₂O稀釋至8µl后，加入1µl 10×DNA loading buffer進行1%瓊脂糖凝膠電泳；或采用2100檢測，測定RNA產(chǎn)物的RIN值。
常見問題及處理方案：

RNA降解	A．細胞或組織取出后沒有馬上處理或冷凍；針對內(nèi)源RNase含量高或不易勻漿的組織，需將組織切成小塊后立即投入液氮冷凍并研磨。在整個研磨過程中，樣品不得融化； B．樣品或提取的RNA沉淀保存于-20℃–室溫，未在-80℃– -60℃保存； C．細胞在胰蛋白酶處理時被破壞； D．溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理； E．提取的RNA有基因組污染； F．電泳時使用的甲酰胺pH低于3.5。
低得率	A．樣品裂解或勻漿處理不徹底； B．在加入異丙醇的手續(xù)步驟中，誤棄RNA； C．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
A₂₆₀/ A₂₈₀<1.65	A．檢測吸光度時，RNA樣品不是溶于TE，而是溶于水。低離子濃度和低pH條件下，A₂₈₀值會較高； B．樣品勻漿時加入的本品體積太少； C．勻漿后樣品未在室溫放置5 min； D．水相中混有有機相；或誤棄水相成分； E．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
DNA污染	A．樣品勻漿時加的本品體積太少； B．樣品中含有組織溶劑（如乙醇、DMSO等），強緩沖液或堿性溶液。
蛋白和多糖污染	A．樣品中蛋白、多糖含量高； B．水相中混有有機相。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于臨床診斷！