產(chǎn)品編號(hào)：BLGE054
| 組分編號(hào) | 產(chǎn)品組成 |
BLGE054 (10 T) |
| BLGE299-30ML | 平衡液BL (Bu?er BL) | 30 mL |
| BLGE300-30ML | 溶液P1 (Bu?er P1) | 30 mL |
| BLGE301-30ML | 溶液P2 (Bu?er P2) | 30 mL |
| BLGE312-15ML | 溶液E3 (Bu?er E3) | 15 mL |
| BLGE313-70ML | 溶液EBT (Bu?er EBT) | 70 mL |
| BLGE316-30ML | 漂洗液GDE (Bu?er GDE) | 30 mL |
| BLGE314-36ML | 漂洗液MRDE (Bu?er MRDE) | 36 mL |
| BLGE315-16ML | 漂洗液PWF (Bu?er PWF) | 16 mL |
| BLGE304-15ML | 洗脫緩沖液TB (Bu?er TB) | 15 mL |
| BLGE305-150UL | RNA酶 A (100 mg/mL RNase A) | 150 μL |
| BLGE306-10pcs | 過濾器CS1 (Filtration CS1) | 10個(gè) |
| BLGE307-10pcs | 吸附柱CP7 (Spin Columns CP7) | 10個(gè) |
| BLGE308-20pcs | 15 mL收集管 (15 mL Collection Tubes) | 20個(gè) |
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說明書 |
產(chǎn)品情況：本試劑盒采用了可高效專一結(jié)合質(zhì)粒DNA的硅膠膜吸附技術(shù),同時(shí)采用EBT溶液和過濾器CS1，可有效的去除內(nèi)毒素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。
推薦過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液使用量為：高拷貝質(zhì)粒為50 mL每次，得率一般在250 - 750 μg左右；低拷貝質(zhì)粒為100 mL每次，得率一般在100 - 300 μg左右。質(zhì)粒的提取得率和質(zhì)量與宿主菌的種類、培養(yǎng)條件、菌體裂解、質(zhì)?？截悢?shù)、質(zhì)粒穩(wěn)定性、抗生素等因素有關(guān)。
使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測(cè)序、連接、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染細(xì)胞等多種實(shí)驗(yàn)。整個(gè)提取過程僅需1h，方便快捷。
儲(chǔ)存運(yùn)輸：常溫運(yùn)輸；
試劑盒在15 - 25℃干燥室溫條件下，可保存12個(gè)月；
試劑盒在2 - 8℃條件下可保存更長(zhǎng)時(shí)間，若溶液產(chǎn)生沉淀，應(yīng)在使用前于37℃溶解沉淀；
單獨(dú)包裝的RNaseA在室溫可穩(wěn)定保存12個(gè)月以上；
加入RNaseA的溶液P1在2 - 8℃條件下可穩(wěn)定保存6個(gè)月。
注意事項(xiàng)：
在使用本試劑盒之前請(qǐng)務(wù)必閱讀此注意事項(xiàng)！
（一）溶液P1在使用前先加入全部的RNase A并混勻，放入2 - 8℃保存。
（二）第一次使用前應(yīng)按照瓶簽說明，先在漂洗液PWF和MRDE中加入無水乙醇。
（三）使用前先檢查平衡液BL、溶液P2、溶液E3和溶液EBT是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，如有結(jié)晶或者沉淀，可在37℃水浴中加熱幾分鐘以使其恢復(fù)澄清。
（四）實(shí)驗(yàn)前使用平衡液BL處理吸附柱，可以最大限度激活硅基質(zhì)膜，提高得率。但用平衡液處理過的柱子最好立即使用，放置時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)影響使用效果。
（五）注意皮膚不能直接接觸溶液P2、E3和EBT，使用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋。
（六）使用過濾器時(shí)請(qǐng)將推柄小心緩慢地從過濾管中抽出，避免濾膜因壓力而松動(dòng)。
（七）提取的質(zhì)粒量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)粒拷貝數(shù)等因素有關(guān)。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)粒或大于10 kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，同時(shí)按比例增加P1、P2、E3 、EBT的用量；洗脫緩沖液推薦在65 - 70℃水浴中預(yù)熱，可以適當(dāng)延長(zhǎng)吸附和洗脫時(shí)間，以提高質(zhì)粒得率。
實(shí)驗(yàn)流程：
注意：
第一次使用前應(yīng)按照瓶簽的說明先在溶液P1中加入全部的RNase A；
第一次使用前應(yīng)按照瓶簽的說明先在漂洗液PWF和MRDE中加入無水乙醇。
（一）步驟1
加2 mL的平衡液BL至吸附柱CP7中 (吸附柱放入15 mL收集管中) ，5,000 rpm(~4,500 xg)離心2 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。
注意：用平衡液處理過的柱子最好立即使用，放置時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)影響使用效果。
（二）步驟2
取20 - 50 mL (根據(jù)培養(yǎng)菌體的濃度選擇合適的量, 低拷貝可用100 mL) 過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管，室溫5,000 rpm(~4,500 xg)離心3 min收集細(xì)菌，盡量吸除上清。
注意：
（1）可以通過多次離心的方法將較多菌液的菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中, 菌體量以保證充分裂解為宜，避免過多的菌體導(dǎo)致的裂解不充分，從而降低質(zhì)粒的提取效率。
（2）盡量吸除上清，為確保上清液全部吸取，請(qǐng)用干凈的吸水紙吸去瓶壁上的水滴。
（三）步驟3
加2.5 mL溶液P1至留有菌體沉淀的離心管中 (請(qǐng)先檢查是否已加入RNase A)，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀。
注意：請(qǐng)務(wù)必徹底懸浮細(xì)菌沉淀，如果有未徹底混勻的菌塊，會(huì)影響裂解效果，導(dǎo)致提 取量和純度偏低。對(duì)于低拷貝質(zhì)粒，加大菌體用量的同時(shí)按比例增加P1、P2、E3和EBT 的用量。
（四）步驟4
加2.5 mL溶液P2至離心管中，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6 - 8次，室溫放置5 min。
注意：溫和混勻，請(qǐng)勿劇烈震蕩，避免基因組DNA污染。裂解后菌液應(yīng)變得清亮粘稠， 如果未變得清亮，可能由于菌體過多導(dǎo)致裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。
（五）步驟5
加1.25 mL溶液E3至離心管中，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6 - 8次，充分混勻，至溶液出現(xiàn)白色分散絮狀沉淀。然后室溫放置2 - 3 min左右。5,000 rpm(~4,500 xg)離心10 min，使白色沉淀離心至管底 (可適當(dāng)增加離心時(shí)間)，將全部溶液小心（緩慢的）倒入過濾器CS1中 (請(qǐng)避免倒入大量沉淀而阻塞過濾器)，慢慢推動(dòng)推柄過濾，濾液收集在干凈的15 mL的管中(自備)。
注意：加入溶液E3后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果離心后倒入過濾器CS1中的溶液有白色沉淀也不會(huì)影響過濾。如果菌體過多 (>50 mL)，推薦延長(zhǎng)離心時(shí)間至20 - 30 min。
（六）步驟6
向?yàn)V液中加入等體積溶液EBT，立即上下翻轉(zhuǎn)7 - 10次，充分混勻。
（七）步驟7
轉(zhuǎn)移4 mL混合液至吸附柱CP7中 (吸附柱放入15 mL收集管中)，室溫5,000 rpm(~4,500 xg)離心3 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP7重新放回收集管中。重復(fù)該步驟直至所有的混合液通過吸附柱CP7。
（八）步驟8
加2 mL漂洗液GDE至吸附柱CP7中，5,000 rpm(~4,500 xg)離心3 min，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
（九）步驟9
加入3 mL漂洗液MRDE (請(qǐng)檢查是否已加入無水乙醇)至吸附柱CP7中，5,000 rpm(~4,500 xg)離心3 min ，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
（十）步驟10
加3.5 mL 漂洗液 PWF(請(qǐng)檢查是否已加入無水乙醇)至吸附柱 CP7 中，5,000 rpm(~4,500 xg)離心3 min，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
注意：重復(fù)該漂洗步驟一次。
（十一）步驟11
5,000 rpm(~4,500 xg)離心10 min，去除吸附柱中殘余的漂洗液。
注意：漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶促反應(yīng)(酶切、PCR等)實(shí)驗(yàn)。建議將吸附柱CP7開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液，以確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響。
（十二）步驟12
將吸附柱CP7置于一個(gè)干凈的15 mL收集管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加0.5 - 1 mL洗脫緩沖液TB，室溫放置2 - 3 min，然后室溫，5,000 rpm(~4,500 xg)離心5 min。將15 mL離心管中的洗脫液全部移入一個(gè)干凈的1.5 mL離心管， -20℃保存。
注意：可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復(fù)步驟12，以增加質(zhì)粒的回收效率。若用ddH2O做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.5 - 8.0 范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率，洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。洗脫緩沖液用量的多少主要是依據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)以及實(shí)驗(yàn)所需要的濃度來確定。洗脫緩沖液體積不少于0.5 mL，體積過小會(huì)影響回收效率。DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防降解。
質(zhì)量檢測(cè)：
（一）可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)得到的質(zhì)粒濃度與純度。OD260值為1相當(dāng)于大約50 μg/mL 雙鏈DNA。純化的質(zhì)粒 OD260/OD280通常在1.7 - 1.9左右，可直接應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染甚至動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等對(duì)質(zhì)粒純度要求很高的實(shí)驗(yàn)中。
（二）如果洗脫時(shí)使用去離子水而不使用洗脫緩沖液，OD260/OD280比值會(huì)偏低，但并不表示純度低，因?yàn)閜H值和離子的存在會(huì)影響光吸收值。
本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于臨床診斷！