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產(chǎn)品編號(hào)： BLGE059
產(chǎn)品規(guī)格： 10T
| 組分編號(hào) | 產(chǎn)品組成 |
BLGE059 (10T) |
| BLGE299-30ML | 平衡液BL (Buffer BL) | 30 mL |
| BLGE300-100ML | 溶液P1 (Buffer P1) | 100 mL |
| BLGE301-100ML | 溶液P2 (Buffer P2) | 100 mL |
| BLGE302-100ML | 溶液P4 (Buffer P4) | 100 mL |
| BLGE303-70ML | 漂洗液PW (Buffer PW) | 70 mL |
| BLGE304-30ML | 洗脫緩沖液TB (Buffer TB) | 30 mL |
| BLGE305-500UL | RNA酶A(RNase A (100 mg/mL)) | 500 μL |
| BLGE306-10pcs | 過(guò)濾器CS1 (Filtration CS1) | 10個(gè) |
| BLGE307-10pcs | 吸附柱CP6 (Spin Columns CP6) | 10個(gè) |
| BLGE308-20pcs | 收集管(50 ml) (Collection Tubes (50 ml)) | 20個(gè) |
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說(shuō)明書(shū) |
產(chǎn)品情況：本試劑盒采用獨(dú)特的硅膠膜吸附技術(shù)，高效專一地結(jié)合質(zhì)粒DNA。同時(shí)采用特殊的溶液
P4和過(guò)濾器CS1，可有效的去除內(nèi)毒素、蛋白等雜質(zhì)；整個(gè)提取過(guò)程僅需1h，方便快捷。
推薦過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液使用量為：高拷貝質(zhì)粒推薦使用量為100 mL，得率一般在500 - 1500μg左右；低拷貝質(zhì)粒推薦使用量為200 mL，得率一般在200 - 600 μg左右。質(zhì)粒的提取得率和質(zhì)量與宿主菌的種類、培養(yǎng)條件、菌體裂解、質(zhì)?？截悢?shù)、質(zhì)粒穩(wěn)定性、抗生素等因素有關(guān)。
使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測(cè)序、連接、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞等實(shí)驗(yàn)。
儲(chǔ)存運(yùn)輸：常溫運(yùn)輸；
試劑盒在15 - 25℃干燥室溫條件下，可保存12個(gè)月；
試劑盒在2 - 8℃條件下可保存更長(zhǎng)時(shí)間，若溶液產(chǎn)生沉淀，應(yīng)在使用前于37℃溶解沉淀；
單獨(dú)包裝的RNaseA在室溫可穩(wěn)定保存12個(gè)月以上；
加入RNaseA的溶液P1在2 - 8℃條件下可穩(wěn)定保存6個(gè)月。
注意事項(xiàng)：
（一）溶液P1在使用前先加入全部的RNase A 并混勻，放入2 - 8℃保存；
（二）第一次使用前應(yīng)按照瓶簽說(shuō)明，先在漂洗液PW中加入無(wú)水乙醇；
（三）使用前先檢查平衡液BL、溶液P2和P4是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，如有結(jié)晶或者沉淀現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清；
（四）實(shí)驗(yàn)前使用平衡液BL處理吸附柱，可以最大限度激活硅基質(zhì)膜，提高得率。但用平衡液處理過(guò)的柱子最好立即使用，放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響使用效果；
（五）注意不要直接接觸溶液P2和P4，使用后應(yīng)立即蓋緊蓋子；
（六）使用過(guò)濾器時(shí)請(qǐng)將推柄小心緩慢地從過(guò)濾管中抽出，避免濾膜因壓力而松動(dòng)；
（七）提取的質(zhì)粒量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)?？截悢?shù)等因素有關(guān)。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?0 kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，同時(shí)按比例增加P1、P2、P4的用量；洗脫緩沖液推薦在65 - 70℃水浴中預(yù)熱?？梢赃m當(dāng)延長(zhǎng)吸附和洗脫時(shí)間，以提高提取效率。
實(shí)驗(yàn)流程：
注意：
第一次使用前應(yīng)按照瓶簽說(shuō)明先在溶液P1中加入全部的RNase A；
第一次使用前應(yīng)按照瓶簽說(shuō)明先在漂洗液PW中加入無(wú)水乙醇。
（一）步驟1
加2.5 mL的平衡液BL至吸附柱CP6中（吸附柱放入50mL收集管中），8,000 rpm (~8,228×g)離心2 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
注意：用平衡液處理過(guò)的柱子最好立即使用，放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響使用效果。
（二）步驟2
取100 mL（根據(jù)培養(yǎng)的菌體的濃度選擇合適的量，低拷貝推薦用200 mL）過(guò)夜培養(yǎng)的菌液加入離心管，室溫，8,000 rpm (~8,228×g)離心3 min收集細(xì)菌，盡量吸除上清。
注意：
（1）可以通過(guò)多次離心的方法將較多菌液的菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中, 菌體量以保證充分裂解為宜，避免過(guò)多的菌體導(dǎo)致的裂解不充分，從而降低質(zhì)粒的提取效率。
（2）盡量吸除上清，為確保上清液全部吸取，請(qǐng)用干凈的吸水紙吸去瓶壁上的水滴。
（三）步驟3
加8 mL溶液P1至留有菌體沉淀的離心管中（請(qǐng)先檢查是否已加入RNase A），使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。
注意：充分懸浮細(xì)菌沉淀，如果有未混勻的菌塊，會(huì)影響裂解，導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。對(duì)于低拷貝質(zhì)粒，加大菌體用量的同時(shí)按比例增加P1、P2、P4的用量。
（四）步驟4
加8 mL溶液P2至離心管中，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6 - 8次，使菌體充分裂解，室溫放置5 min。
注意：混合時(shí)務(wù)必溫和，以免發(fā)生基因組DNA污染?；旌虾缶簯?yīng)變得清亮粘稠，裂解時(shí)間控制在5 min內(nèi)，以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變清亮，可能由于菌體過(guò)多，導(dǎo)致裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。
（五）步驟5
加8 mL溶液P4至離心管中，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6 - 8次以充分混勻，至溶液出現(xiàn)白色分散絮狀沉淀。然后室溫放置10 min左右。8,000 rpm (~8,228×g)離心5 - 10 min，使白色沉淀離至管底（可適當(dāng)增加離心時(shí)間），將全部溶液小心（緩慢的）倒入過(guò)濾器CS1中（請(qǐng)避免倒入大量沉淀而阻塞過(guò)濾器），慢慢推動(dòng)推柄過(guò)濾，濾液收集在干凈的50 mL的管中（自備）。
注意：加入溶液P4后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果離心后倒入過(guò)濾器CS1中的溶液有白色沉淀也不會(huì)影響過(guò)濾。如果菌體過(guò)多（>100 mL），推薦延長(zhǎng)離心時(shí)間至20 - 30 min。
（六）步驟6
加入0.3倍濾液體積的異丙醇至濾液中，上下顛倒混勻后轉(zhuǎn)移到吸附柱CP6中（吸附柱放入50 mL收集管中）。
注意：過(guò)濾后濾液會(huì)損失，根據(jù)損失的不同請(qǐng)加入不同體積的異丙醇，加入異丙醇過(guò)多容易導(dǎo)致RNA污染。吸附柱CP6的最大容積為15 mL，所以需要分2次過(guò)柱。個(gè)別情況下離心機(jī)角轉(zhuǎn)子傾角較大，此時(shí)，建議加入吸附柱CP6的溶液體積不超過(guò)10 mL，以防漏液。
（七）步驟7
室溫8,000 rpm (~8,228×g)離心2 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP6重新放回收集管中。
注意：將第6步中所得溶液分2次過(guò)柱，每次均按以上條件操作。
（八）步驟8
加10 mL漂洗液PW（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇）至吸附柱CP6中，8,000 rpm
(~8,228×g)離心2 min，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
注意：重復(fù)步驟8一次。
（九）步驟9
加3 mL無(wú)水乙醇至吸附柱CP6中，室溫8,000 rpm (~8,228×g)離心2 min，倒掉廢液。
（十）步驟10
將吸附柱CP6重新放回收集管中，8,000 rpm (~8,228×g)離心5 min，去除吸附柱中殘余的漂洗液。
注意：漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（酶切、PCR等）實(shí)驗(yàn)。建議將吸附柱CP6開(kāi)蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液，以確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響。
（十一）步驟11
將吸附柱CP6置于一個(gè)干凈的50 mL收集管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加1 - 2 mL洗脫緩沖液TB，室溫放置5 min，然后室溫8,000 rpm (~8,228×g)離心2 min。將50 mL離心管中的洗脫液全部移入一個(gè)干凈的1.5 mL離心管，-20℃保存。
注意：可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復(fù)步驟11，以增加質(zhì)粒的回收效率。若用ddH2O做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.5 - 8.0范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率，洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。洗脫液用量的多少主要是根據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)以及實(shí)驗(yàn)所需要的濃度來(lái)確定。洗脫液體積不少于1 mL，體積過(guò)小會(huì)影響回收效率。DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防降解。
（十二）步驟12（可選步驟）
加1.42 mL異丙醇以及0.42 mL 5mol/L的 NaCl (自備)至每1 mL洗脫液中，混勻，室溫放置5 min，8,000 rpm (~8,228×g)離心10 min，小心棄上清。
（十三）步驟13（可選步驟）
加入0.5 mL 的70%乙醇洗滌沉淀, 室溫 8,000 rpm (~8,228×g)離心5 min，小心棄乙醇。
注意：重復(fù)步驟13一次。
（十四）步驟14（可選步驟）
空氣中干燥沉淀約5 - 10 min, 根據(jù)需要用適當(dāng)體積的TB緩沖液溶解沉淀。
質(zhì)量檢測(cè)
（一）可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)得到的質(zhì)粒濃度與純度。OD260值為1相當(dāng)于大約50 μg/mL 雙鏈DNA。純化的質(zhì)粒 OD260/OD280通常在1.8 - 2.0左右，可直接應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染甚至動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等對(duì)質(zhì)粒純度要求很高的實(shí)驗(yàn)中。
（二）如果洗脫時(shí)使用去離子水而不使用洗脫緩沖液，OD260/OD280比值會(huì)偏低，但并不表示純度低，因?yàn)閜H值和離子的存在會(huì)影響光吸收值。
本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于臨床診斷！