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產(chǎn)品名稱：EndoFree Mini Plasmid Kit II 無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒
產(chǎn)品編號(hào)：BLGE060
產(chǎn)品規(guī)格：
| 組分編號(hào) | 產(chǎn)品組成 |
BLGE060 (50T) |
BLGE060 (5T) |
| BLGE299-30ML | 平衡液BL (Buffer BL) | 30 mL | 3 mL |
| BLGE300-30ML | 溶液P1 (Buffer P1) | 30 mL | 3 mL |
| BLGE301-30ML | 溶液P2 (Buffer P2) | 30 mL | 3 mL |
| BLGE302-30ML | 溶液P4 (Buffer P4) | 30 mL | 3 mL |
| BLGE309-30ML | 去蛋白液PD (Buffer PD) | 30 mL | 3 mL |
| BLGE303-15ML | 漂洗液PW (Buffer PW) | 15 mL | 1.5 mL |
| BLGE304-15ML | 洗脫緩沖液TB (Buffer TB) | 15 mL | 1.5 mL |
| BLGE305-300μl | RNaseA (10 mg/mL) | 300 μL | 30 μL |
| BLGE311-50pcs | 過濾柱CS (Filtration Columns CS) | 50個(gè) | 5個(gè) |
| BLGE307-50pcs | 吸附柱CP4 (Spin Columns CP4) | 50個(gè) | 5個(gè) |
| BLGE308-100pcs | 收集管(2 mL) (Collection Tubes 2 mL) | 50個(gè)× 2 | 10個(gè) |
產(chǎn)品情況：本試劑盒采用了可高效專一結(jié)合質(zhì)粒DNA的硅膠膜吸附技術(shù)。同時(shí)采用特殊的溶液P4和過濾柱CS，可有效的去除內(nèi)毒素、蛋白等雜質(zhì)；整個(gè)提取過程僅需1個(gè)小時(shí)，方便快捷。
推薦過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液使用量為5 - 15 mL每次，高拷貝質(zhì)粒得率一般在15 - 70 µg左右；低拷貝質(zhì)粒得率一般在100 - 300 µg左右。質(zhì)粒的提取得率和質(zhì)量與宿主菌的種類、培養(yǎng)條件、菌體裂解、質(zhì)?？截悢?shù)、質(zhì)粒穩(wěn)定性、抗生素等因素有關(guān)。
使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞及各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測(cè)序、連接等實(shí)驗(yàn)。
儲(chǔ)存運(yùn)輸：常溫運(yùn)輸；
試劑盒在15 - 25℃干燥室溫條件下，可保存12個(gè)月；
試劑盒在2 - 8℃條件下可保存更長時(shí)間；
單獨(dú)包裝的RNaseA在室溫可穩(wěn)定保存12個(gè)月以上；
溶液P1加入RNaseA后，在2 - 8℃條件下可穩(wěn)定保存6個(gè)月。
注意事項(xiàng)：
在使用本試劑盒之前請(qǐng)務(wù)必閱讀此注意事項(xiàng)！
（一）當(dāng)試劑盒在2 - 8℃低溫貯存時(shí)，使用前應(yīng)先將試劑盒內(nèi)的溶液在室溫中放置一段時(shí)間，必要時(shí)可在37℃水浴中預(yù)熱10 min，以平衡溶液溫度；
（二）溶液P1在使用前先加入全部的RNase A 并混勻，放入2 - 8℃保存；
（三）第一次使用前應(yīng)按照瓶簽說明，先在漂洗液PW中加入無水乙醇；
（四）使用前先檢查平衡液BL、溶液P2和P4是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，如有結(jié)晶或者沉淀，可在37℃水浴中加熱幾分鐘以使其恢復(fù)澄清；
（五）實(shí)驗(yàn)前使用平衡液BL處理吸附柱，可以最大限度激活硅基質(zhì)膜，提高得率；但用平衡液處理過的柱子最好立即使用，放置時(shí)間過長會(huì)影響使用效果；
（六）注意不要直接接觸溶液P2和P4，使用后應(yīng)立即蓋緊蓋子；
（七）提取的質(zhì)粒量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)粒拷貝數(shù)等因素有關(guān)；如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?0 kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，同時(shí)按比例增加P1、P2、P4的用量，洗脫緩沖液應(yīng)在65 - 70℃預(yù)熱，可以適當(dāng)?shù)难娱L吸附和洗脫的時(shí)間，以增加提取效率；
（八）所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)室溫下進(jìn)行離心，速度為12,000 rpm (~13,400×g )。
實(shí)驗(yàn)流程：
注意：
第一次使用前應(yīng)按照瓶簽的說明先在溶液P1中加入全部的RNase A；
第一次使用前應(yīng)按照瓶簽的說明先在漂洗液PW中加入無水乙醇。
（一）步驟1
加500μL的平衡液BL至吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g ) 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
注意：用平衡液處理過的柱子最好立即使用，放置時(shí)間過長會(huì)影響使用效果。
（二）步驟2
取5 - 15 mL過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心1 min，盡量吸除上清。
注意：可以通過多次離心的方法將較多菌液的菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中, 菌體量以保證充分裂解為宜，避免過多的菌體導(dǎo)致的裂解不充分，從而降低質(zhì)粒的提取效率。
（三）步驟3
加500μL溶液P1至離心管中（請(qǐng)檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀。
注意：充分懸浮細(xì)菌沉淀，如果有未混勻的菌塊，會(huì)影響裂解，導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。
（四）步驟4
加500μL溶液P2至離心管中，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6 - 8次使菌體充分裂解。
注意：務(wù)必溫和混合，以免發(fā)生基因組DNA污染?；旌虾缶簯?yīng)變得清亮粘稠，裂解時(shí)間控制在5 min內(nèi)，以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變清亮，可能由于菌體過多，導(dǎo)致裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。
（五）步驟5
加500μL溶液P4至離心管中，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6 - 8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，然后室溫放置10 min左右，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心10 min，此時(shí)沉淀在離心管底部聚集；如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后收取上清。
注意：P4加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。
（六）步驟6
將步驟5收集的上清液分次加入過濾柱CS（過濾柱放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g ) 離心2 min，自備干凈的2 mL離心管，收集濾液。
（七）步驟7
加0.3倍濾液體積的異丙醇至濾液中，上下顛倒混勻后轉(zhuǎn)移到吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中），室溫12,000 rpm (~13,400×g)離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
注意：過濾后濾液會(huì)損失，根據(jù)損失的不同請(qǐng)加入不同體積的異丙醇，加入異丙醇過多容易導(dǎo)致RNA污染。吸附柱CP4的最大容積為700μL，所以需要分次過柱。
（八）步驟8
加500μL去蛋白液PD至吸附柱CP4中，12,000 rpm (~13,400×g )離心1 min，倒掉 收集管中的廢液，將吸附柱CP4放入收集管中。
（九）步驟9
加600μL漂洗液PW至吸附柱CP4中（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm
(~13,400×g ) 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP4放入收集管中。
注意：加入漂洗液PW后室溫靜置2 - 5 min，有助于更好地溶解去除雜質(zhì)。
（十）步驟10
重復(fù)步驟9一次。
（十一）步驟11
將吸附柱CP4重新放回收集管中，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心2 min，去除吸附柱中殘余的漂洗液。
注意：漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實(shí)驗(yàn)。建議將吸附柱CP4開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液，以確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響。
（十二）步驟12
懸空滴加100 - 300μL洗脫緩沖液TB至吸附膜的中間部位（吸附柱CP4置于一個(gè)干凈的離心管中），室溫放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心1 min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。
注意：可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復(fù)步驟12，以增加質(zhì)粒的回收效率。洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用ddH2O做洗脫液應(yīng)保證其pH值7.5 - 8.0 范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。洗脫緩沖液用量不應(yīng)少于100μL，體積過小影響回收效率。且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在 - 20℃，以防DNA降解。
質(zhì)量檢測(cè)：
（一）可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)得到的質(zhì)粒濃度與純度。OD260值為1相當(dāng)于大約50 μg/mL 雙鏈DNA。純化的質(zhì)粒 OD260/OD280通常在1.7 - 1.9左右，可直接應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染甚至動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等對(duì)質(zhì)粒純度要求很高的實(shí)驗(yàn)中。
（二）如果洗脫時(shí)使用ddH2O而不使用洗脫緩沖液，OD260/OD280比值會(huì)偏低，但并不表示純度低，因?yàn)閜H值和離子的存在會(huì)影響光吸收值。
本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于臨床診斷！