引物

是指在核苷酸聚合作用起始時，刺激合成的一類具有特定核苷酸序列的大分子，與反應(yīng)物以氫鍵形式連接，這樣的分子成為引物。一般是由人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與靶區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個引物與靶區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點，核算聚合酶可由其3端開始合成新的核酸鏈。體外人工設(shè)計的引物被廣泛用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、測序以及探針合成等。

引物設(shè)計的3條基本原則

首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，然后引物與引物之間要避免形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或二聚體，接著引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)（即錯配）。
其中影響引物設(shè)計的因素諸多，如引物長度（Primer length），產(chǎn)物長度（Product length），引物及產(chǎn)物的GC含量（Composition），序列Tm值（Melting temperature），
在錯配位點（False priming site）的引發(fā)效率，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性（Internal stability，用ΔG值反應(yīng)），形成引物二聚體（Primer dimer）及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Dupl
exformation andhairpin）的能值，等等。必要時還需要對引物進(jìn)行一定的修飾，如增加限制性核酸內(nèi)切酶位點，引進(jìn)突變等。以下為部分因素介紹。

長度：引物長度（Primer length）常用的是18~27bp，但不應(yīng)大于38。因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。

GC含量：引物序列的GC含量一般為40~60%，含量過高或著過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。且上下游引物的GC含量不能相差過大。

Tm值：引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可以使復(fù)性條件達(dá)到最佳。而Tm的計算方法有很多種。公式Tm=4（G+C）+2（A+T）在Oligo軟件中使用的是最鄰近法。

選擇T：在引物3’端錯配是，不同堿基的引發(fā)效率有著很大差異。當(dāng)末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成；但當(dāng)末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大
大降低。G、C錯配的引發(fā)效率介于 A、T之間，所以3’端最好選擇T。且引物3’端要避開密碼子第三位，如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3’端不要終止于密碼子的第3位，
因為密碼子的第3位容易發(fā)生簡并，會影響擴(kuò)增的特異性與效率。

自身避免互補(bǔ)：引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使得引物本身復(fù)性。而兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其要避免3’端的互補(bǔ)重疊
以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。

ΔG值：ΔG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映的是雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性，ΔG值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5’端和中間ΔG值相對較高，而3’端ΔG
值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3’端的ΔG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。
5’端可修飾：引物的5’端決定了PCR產(chǎn)物的長度，它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可被修飾且不影響擴(kuò)增的特異性。方法有很多，如加酶切位點；標(biāo)記生物素、熒光、地
高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列、插入突變、引入點突變、缺失突變序列等等。